前言
本標準代替GB5009.5—2010《食品安全(quán)國家標準食品中蛋(dàn)白質的測定》，GB/T14889.2—2008《糧油檢驗植物油料(liào)粗蛋白質的測定》，GB/T15673—2009《食用菌中粗蛋白質含量(liáng)的(dí)測定》，GB/T5511—2008《穀(gǔ)物和(hé)豆類氮含(hán)量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法》，GB/T9695.11—2008《肉(ròu)與(yǔ)肉製品氮含量測定》和GB/T9832—2008《糧(liáng)油檢驗植(zhí)物油料餅粕含氮量的測定》。本標準與(yǔ)GB5009.5—2010相比，
主(zhǔ)要變化如(rú)下(xià)：——增加附錄A蛋白質折算係數(shù)。
1範圍
本標(biāo)準規定了食品中蛋白質(zhì)的(dí)測定方法。
本標準第一法和第二(èr)法適(shì)用於各種(zhǒng)食品中蛋白質的測定，第三(sān)法適用於(yú)蛋白質含量在10g/100g以上的糧食，豆類奶粉，米粉(fěn)🛄，蛋白質(zhì)粉等固體試樣(yàng)的測定。
本標準不(bù)適用於(yú)添加(jiā)無機含氮物質🤔，有機非蛋白質含氮物質的(dí)食品的(dí)測(cè)定。
第一法凱(kǎi)氏(shì)定(dìng)氮(dàn)法
2原理食品中(zhōng)的蛋(dàn)白質(zhì)在(zài)催化加(jiā)熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。鹼化蒸餾使氨遊離，用(yòng)硼酸吸收後以(yǐ)硫酸或鹽酸標(biāo)準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮(dàn)含量，再乘以換算係數，即為蛋白(bái)質的含量🃊。
3試劑和材料
3.1試劑(jì)
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定(dìng)的三級水。
3.1.1硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）。
3.1.2硫酸鉀（K₂SO₄）。
3.1.3硫酸（H₂SO₄）📐。
3.1.4硼酸（H₃BO₃）。
3.1.5甲基紅指示劑（C₁₅H₁₅N₃O₂）🤚。
3.1.6溴甲酚綠指示劑（C₂₁H₁₄Br₄O₅S）🦓。
3.1.7亞(yà)甲基藍(lán)指示劑（C₁₆H₁₈ClN₃S·3H₂O）。
3.1.8氫氧化(huà)鈉（NaOH）。
3.1.9 95%乙醇（C₂H₅OH）。
3.2試劑配製
3.2.1硼酸溶(róng)液（20g/L）：稱取(qǔ)20g硼酸，加水溶解後並稀釋(shì)至1000mL。
3.2.2氫氧化鈉溶液(yè)（400g/L）🀒：稱取40g氫氧化(huà)鈉加水溶(róng)解後，放冷，並稀釋至100mL。
3.2.3硫酸標準滴定溶液[c（1/2H₂SO₄）]0.0500mol/L或鹽酸標準滴定溶液[c（HCl）]0.0500mol/L。
3.2.4甲基紅(hóng)乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g甲基紅，溶(róng)於95%乙醇🖊，用95%乙醇稀釋至100mL🛡。
3.2.5亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g亞甲基藍(lán)，溶於95%乙醇，用95%乙醇(chún)稀釋至100mL🔡。
3.2.6 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱(chēng)取(qǔ)0.1 g溴甲酚(fēn)綠，溶於95 %乙醇，用95 %乙醇稀釋至100 mL🕇。
3.2.7 A混合(hé)指示液：2份甲基紅乙醇溶液與1份亞(yà)甲基(jī)藍乙醇溶液臨用時混合。
3.2.8 B混合(hé)指示液：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲(jiǎ)酚(fēn)綠乙醇溶(róng)液臨用時混合。
4 儀器(qì)和設備
4.1 天平：感量為1 mg。
4.2 定氮蒸餾裝(zhuāng)置🍵：如圖1所示。
4.3 自動(dòng)凱氏定氮儀。
說(shuō)明：
1——電爐🗖；
2——水蒸氣發(fā)生器（2 L燒瓶）；
3——螺旋夾；
4——小(xiǎo)玻(bō)杯及棒狀(zhuàng)玻塞；
5——反應室；
6——反應(yīng)室(shì)外層；
7——橡皮(pí)管(guǎn)及(jí)螺(luó)旋夾；
8——冷(lěng)凝管；
9——蒸餾液接(jiē)收瓶。
圖1 定(dìng)氮蒸餾裝置圖
5 分析步驟
5.1 凱氏定氮法
5 分析步驟
5.1 凱(kǎi)氏定氮法
5.1.1 試樣處理📔：稱取(qǔ)充分混匀的固體試樣0.2 g～2 g，半固體(tǐ)試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當於30 mg～40 mg氮），精確至0.001 g，移入(rù)幹燥的100 mL，250 mL或500 mL定氮瓶中，加入(rù)0.4 g硫酸銅，6 g硫酸鉀及20 mL硫酸，輕搖後於瓶口放一小漏鬥，將瓶(píng)以(yǐ)45°角(jiǎo)斜支於有小孔的石棉網上。小心(xīn)加(jiā)熱，待內容物全部碳(tàn)化💀，泡(pào)沫完全停止後，加強火力🤬，並保持瓶內液體微沸，至液體呈(chéng)藍綠色並澄清(qīng)透明後，再(zài)繼續(xù)加熱(rè)0.5 h～1 h🚆。取下(xià)放冷，小(xiǎo)心加入(rù)20 mL水。放冷後，移入100 mL容量瓶中(zhōng)，並用(yòng)少量水洗(xǐ)滌(dí)定氮瓶，洗液並入(rù)容(róng)量(liáng)瓶中，再加水至刻度，混匀(yún)備用😯。同時做試劑空白試驗。
5.1.2 測定：按圖1裝(zhuāng)好定(dìng)氮蒸餾裝置(zhì)，向水蒸氣發生(shēng)器內裝水至2/3處，加入數粒玻璃珠，加(jiā)甲基紅乙醇(chún)溶液數滴及數毫升硫酸(suān)，以保持水呈酸性(xìng)，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內的(dí)水並保(bǎo)持沸騰。
5.1.3 向接收瓶內加入10.0 mL硼酸溶液(yè)及(jí)1滴～2滴(dī)混合指示(shì)液（B）並保持滿(mǎn)瓶📦，並(bìng)使(shǐ)冷凝管的(dí) 下端插入液麵下(xià)，根據試樣(yàng)中氮含量，準(zhǔn)確吸取2.0 mL～10.0 mL試(shì)樣處理液由小玻(bō)杯注入反應室，以(yǐ)10 mL水(shuǐ)洗滌小玻杯並(bìng)使之流入(rù)反應室(shì)內🍱，隨後塞(sāi)緊棒狀玻塞。將(jiāng)10.0 mL氫氧化鈉溶液(yè)倒入(rù)小玻杯，提(tí)起玻塞使其緩緩流入反應室，立即(jí)將(jiāng)玻塞蓋(gài)緊(jǐn)🧤，並加水(shuǐ)封。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾10 min 後移動蒸餾液接收瓶📈，液麵離開(kāi)冷凝管下端，再蒸(zhēng)餾1 min。然後用少量水衝洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫(liú)酸或鹽酸標準(zhǔn)滴(dī)定溶液滴定至終點，如用(yòng)A混合指示液，終點顏色為灰藍色；如用(yòng)B混合指示液，終點顏色為(wéi)淺紅色。同時做試劑(jì)空白(bái)。
5.2 自動凱(kǎi)氏定(dìng)氮(dàn)儀法
稱取充分混匀的(dí)固體試樣0.2 g～2 g，半固體試(shì)樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當於(yú)30 mg～40 mg氮(dàn)），精確至0.001 g，至消(xiāo)化管中，再加入0.4 g硫酸銅，6 g硫酸鉀及20 mL硫(liú)酸於消化(huà)爐進行(háng)消化。當消(xiāo)化爐溫度達到420℃後，繼續(xù)消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明(míng)狀(zhuàng)，取出冷卻後加入50 mL水，於自(zì)動凱氏定氮儀（使用前(qián)加入(rù)氫氧化鈉溶(róng)液，鹽酸或硫(liú)酸標準溶液以及含有混合指(zhǐ)示劑A或B的硼酸溶液）上實現(xiàn)自(zì)動加液，蒸餾，滴(dī)定和(hé)記(jì)錄(lù)滴定數據的過程。
6 分析(xī)結(jié)果的表述
試樣(yàng)中蛋白質的含(hán)量按式(1)計算：
式中🕜：
X——試樣中蛋白質的含量(liáng)，單位為克(kè)每百克(kè)（g/100g）👎；
V₁——試(shì)液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，單位為毫升（mL）🧮；
V₂——試劑空白消耗硫酸或鹽(yán)酸標準(zhǔn)滴定液的體積，單(dān)位為毫升（mL）；
c——硫酸或鹽酸(suān)標準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾(ěr)每升(shēng)（mol/L）🍀；
0.0140——1.0 mL硫酸[c（\(\frac{1}{2}\)H₂SO₄） = 1.000 mol/L]或鹽酸[c（HCl） = 1.000 mol/L]標準(zhǔn)滴(dī)定溶(róng)液(yè)相當的(dí)氮的質量，單位為克（g）；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）🥖；
V₃——吸取消化液的體積(jī)，單(dān)位為毫升（mL）🦇；
F——氮換算(suàn)為蛋白質的係(xì)數🎰，各(gè)種食品中氮轉換係數見附(fù)錄A；
100——換算係(xì)數(shù)。
蛋白(bái)質含(hán)量≥1 g/100 g時，結果保留三位有效數字；蛋白質含量＜1 g/100 g時，結果保留兩位(wèi)有效數字(zì)。
注(zhù)🧴：當隻(zhī)檢測氮含量時，不需要乘蛋白質換算係數(shù)F。
7 精(jīng)密度(dù)
在重復(fù)條件下獲得的兩次(cì)獨立測定結果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
第二法 分(fēn)光光度法(fǎ)
8 原理
食品(pǐn)中的(dí)蛋白質在催化加熱(rè)條件下被分解，分解產生的(dí)氨與硫酸結合生成硫酸銨🃧，在(zài)pH 4.8的乙酸鈉 - 乙酸緩衝溶液中(zhōng)與乙(yǐ)酰丙酮和甲醛反應生成黃色的 3,5 - 二(èr)乙(yǐ)酰 - 2,6 - 二甲(jiǎ)基 - 1,4 - 二(èr)氫化吡啶(dìng)化合物。在波長 400 nm 下測定吸光度值，與標準係列比較定量，結果(guǒ)乘以換(huàn)算係數(shù)，即為(wéi)蛋白(bái)質含量。
9 試劑(jì)和(hé)材料
9.1 試(shì)劑
除(chú)非另有說明，本方法所用(yòng)試劑均為分析(xī)純，水為 GB/T 6682 規定的三級(jí)水🎮。
9.1.1 硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）。
9.1.2 硫酸鉀（K₂SO₄）。
9.1.3 硫(liú)酸（H₂SO₄）：優級純。
9.1.4 氫氧化鈉（NaOH）。
9.1.5 對硝(xiāo)基苯酚（C₆H₅NO₃）🥐。
9.1.6 乙酸(suān)鈉（CH₃COONa·3H₂O）。
9.1.7 無水乙酸(suān)鈉（CH₃COONa）🌖。
9.1.8 乙酸（CH₃COOH）：優級純(chún)🔛。
9.1.9 37%甲醛(quán)（HCHO）。
9.1.10 乙酰丙(bǐng)酮（C₅H₈O₂）。9.2 試劑(jì)配製
9.2.1 氫氧化(huà)鈉溶液（300 g/L）：稱取30 g氫氧化鈉加(jiā)水(shuǐ)溶解後，放(fàng)冷，並(bìng)稀釋至100 mL。
9.2.2 對(duì)硝基苯酚指示劑溶(róng)液（1 g/L）：稱(chēng)取0.1 g對(duì)硝(xiāo)基苯(běn)酚指示劑溶於20 mL 95 %乙醇中，加水稀釋至100 mL。
9.2.3 乙(yǐ)酸(suān)溶液（1 mol/L）：量取5.8 mL乙(yǐ)酸，加水稀釋至100 mL。
9.2.4 乙酸鈉溶液（1 mol/L）：稱取41 g無(wú)水乙酸鈉或68 g乙酸鈉(nà)🚉，加(jiā)水溶解稀(xī)釋至500 mL。
9.2.5 乙酸鈉 - 乙酸緩衝溶(róng)液：量(liáng)取60 mL乙(yǐ)酸鈉溶(róng)液與40 mL乙酸溶液混合(hé)，該溶(róng)液pH 4.8。
9.2.6 顯色劑：15 mL甲醛與7.8 mL乙酰丙酮混合，加水(shuǐ)稀釋至100 mL，劇烈振(zhèn)搖混匀（室(shì)溫下放置穩定3d）🦵。
9.2.7 氨氮標準儲備溶(róng)液（以氮計）（1.0 g/L）：稱取105℃幹燥2 h的(dí)硫酸(suān)銨0.472 0 g加水溶解後移於100 mL容量瓶中，並(bìng)稀釋至刻度，混匀，此溶液每毫升相當於1.0 mg氮(dàn)。
9.2.8 氨氮標準使用溶(róng)液（0.1 g/L）🂭：用移液管吸取10.00 mL氨氮(dàn)標準儲備液(yè)於100 mL容(róng)量瓶內，加水定容至(zhì)刻度🃆，混匀，此溶液每毫升相當於0.1 mg氮🐄。
10 儀器和設備
10.1 分光光度計。
10.2 電熱恒溫水浴鍋：100℃±0.5℃🚎。
10.3 10 mL具塞玻(bō)璃比(bǐ)色管。
10.4 天平(píng)：感量(liáng)為1 mg。
11 分(fēn)析(xī)步驟
11.1 試樣消解
稱取充(chōng)分(fēn)混(hùn)匀的固(gù)體試樣0.1 g～0.5 g（精確至0.001 g），半固(gù)體(tǐ)試樣0.2 g～1 g（精確至0.001 g）
或液體試樣1 g～5 g（精確至0.001 g），移入(rù)幹燥的100 mL或250 mL定氮瓶中(zhōng)，加入0.1 g硫酸(suān)銅，1 g硫酸(suān)鉀及5 mL硫酸，搖匀後(hòu)於瓶口放(fàng)一小(xiǎo)漏(lòu)鬥，將定氮瓶以45°角斜支於有小孔的石棉(mián)網上。緩慢(màn)加熱(rè)，待內容物全部炭化，泡沫完(wán)全停止後，加(jiā)強火力🏊，並保持瓶內液體(tǐ)微沸，至液(yè)體呈藍綠(lǜ)色澄清透明後，再繼續加熱0.5 h。取下放冷，慢慢加入(rù)20 mL水，放冷後移入50 mL或(huò)100 mL容量瓶中(zhōng)，並用少量水(shuǐ)洗滌定氮瓶(píng)，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混匀備用。按同一方法(fǎ)做試劑空白(bái)試驗。
11.2 試樣溶(róng)液的(dí)製(zhì)備
吸取2.00 mL～5.00 mL試樣或試(shì)劑(jì)空白(bái)消化液於50 mL或(huò)100 mL容量瓶(píng)內，加1滴(dī)～2滴對硝(xiāo)基苯酚指示(shì)劑溶(róng)液🦲，搖匀後滴加氫氧化鈉溶液中(zhōng)和(hé)至黃色，再滴(dī)加乙酸(suān)溶液至溶液(yè)無(wú)色，用水稀釋至刻(kè)度，混匀(yún)。
11.3 標準曲綫的繪製
吸(xī)取0.00 mL，0.05 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL和(hé)1.00 mL氨氮標(biāo)準使用溶液(yè)（相當於0.00 μg，5.00 μg，10.0 μg，20.0 μg，40.0 μg，60.0 μg，80.0 μg和100.0 μg氮），分別置於(yú)10 mL比(bǐ)色管中。加4.00 mL乙酸鈉(nà) - 乙(yǐ)酸緩(huǎn)衝溶液及4.00 mL顯色劑，加水稀釋(shì)至(zhì)刻度，混匀。置於(yú)100℃水浴中加熱15 min。取(qǔ)出用水冷卻至室溫後，移入(rù)1 cm比色杯內，以零(líng)管為參比，於波長400 nm處測(cè)量吸(xī)光度值，根據標準各點吸光度值繪(huì)製標準曲(qū)綫或計算綫性回歸(guī)方程。
11.4 試樣(yàng)測定
吸取0.50 mL～2.00 mL（約相當於氮＜100 μg）試樣溶液和同量的試(shì)劑空白溶液，分別於10 mL比色(sè)管中。加4.0 mL乙酸鈉 - 乙酸緩衝液及(jí)4.0 mL顯色劑，加水稀釋(shì)至刻度，混匀。置於100℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫後，移入1 cm比(bǐ)色杯內(nèi)，以零管為參比，於(yú)波長400 nm處測(cè)量(liáng)吸光度值，試樣吸光度值與標準曲綫比較定量(liáng)或代入綫性回歸方程求出含量。
12 分析結(jié)果的表述
試樣中蛋白(bái)質的含量按式(2)計算(suàn)：
式中：
X——試樣中蛋白質的含量(liáng)，單位為克每(měi)百克（g/100g）；
C——試樣測定液中氮(dàn)的含量(liáng)，單位為微(wēi)克(kè)（μg）；
C₀——試劑空白測定液(yè)中氮的含量，單位為(wéi)微克(kè)（μg）；
V₁——試樣消化液定(dìng)容體積，單位(wèi)為毫升（mL）；
V₂——試(shì)樣溶液總體積(jī)，單位為毫升（mL）；
m——試(shì)樣質量(liáng)，單位為克（g）；
V₃——製備試樣溶液的消(xiāo)化液(yè)體積🤗，單位為毫(háo)升（mL）；
V₄——測定(dìng)用試樣溶液體積，單(dān)位為毫升(shēng)（mL）；
1000——換算係數；
100——換算係數；
F——氮(dàn)換算為蛋白質的(dí)係(xì)數。
蛋白質含量(liáng)≥1g/100g時，結果保留三位有效數字；蛋白質(zhì)含量(liáng)＜1g/100g時，結果保留(liú)兩位有效數字。
13 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定(dìng)結果的絕(jué)對差值不得超過算術平(píng)均(jūn)值的(dí)10%🖫。
第三法 燃燒法
14 原(yuán)理
試(shì)樣在900℃～1 200℃高溫下燃(rán)燒🖟，燃(rán)燒(shāo)過程中產生混合氣體，其中的碳，硫等幹(gān)擾氣體和鹽類被吸收管吸收(shōu)，氮氧化物被全部還原成氮氣🗄，形成(chéng)的氮氣流通過熱導檢測器（TCD）進行檢測(cè)🃟。
15 儀器(qì)和設備
15.1 氮/蛋白質分(fēn)析(xī)儀。
15.2 天平：感量為0.1 mg。
16 分析步驟
按照(zhào)儀器說明書要求稱(chēng)取0.1 g～1.0 g充分混匀(yún)的試樣（精確至0.000 1 g），用(yòng)錫箔包裹後置於樣品盤上。試(shì)樣進入燃燒反應爐（900℃～1200℃）後🚀，在高純氧(yǎng)（≥99.99%）中充分燃(rán)燒。燃燒爐中的產物（NOₓ）被(bèi)載氣二氧化(huà)碳或氦氣運送(sòng)至還原爐（800℃）中，經還原生成氮氣(qì)後(hòu)檢測其含量(liáng)。
17 分析(xī)結果的(dí)表述
試樣中(zhōng)蛋(dàn)白質的含量(liáng)按式(3)計算：
式(shì)中(zhōng)：
X——試樣中蛋白質的含量，單位(wèi)為克每百克（g/100g）；
C——試樣(yàng)中氮(dàn)的(dí)含(hán)量，單位為克每百克（g/100g）；
F——氮換算為蛋白質的係數。
結果保留三位有效數字(zì)。
18 精密度
在重復性條件下獲得的(dí)兩次獨立(lì)測定結果的(dí)絕對(duì)差值不得超過算術平均值的10%🦔。
19 其他(tā)
本方法(fǎ)第(dì)一法(fǎ)當稱樣量為5.0 g時，檢出限為8 mg/100 g。
本方法第二法當稱(chēng)樣量(liáng)為5.0 g時，檢出限為0.1 mg/100 g。
附 錄 A
常見(jiàn)食物中的氮折算成蛋白質的折算係數
常見食物(wù)中的(dí)氮折算(suàn)成(chéng)蛋(dàn)白質的折算係(xì)數見表 A.1。
表A.1 蛋白(bái)質折(zhē)算係數表
